重點(diǎn)與難點(diǎn)

乳膏劑是一種常用于濕疹、皮炎、皰疹等局部皮膚病治療的外用半固體制劑，其基質(zhì)一般由水相和油相兩相組成，藥物則以溶解或混懸狀態(tài)分布于基質(zhì)中，因此被認(rèn)為是典型的“大簡(jiǎn)至繁"的復(fù)雜制劑，即處方組成簡(jiǎn)單，但微觀結(jié)構(gòu)復(fù)雜且工藝難點(diǎn)多，包括藥物晶型、混懸的藥物顆粒大小和形貌、油水兩相之間的界面張力、液滴粒徑分布與穩(wěn)定性、流變學(xué)特性等等，其中API和液滴顆粒的粒度分布對(duì)生物利用度和制劑物理穩(wěn)定性的影響最為關(guān)鍵，因此是乳膏劑產(chǎn)品開發(fā)和質(zhì)量控制中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

藥物研發(fā)中常用的粒徑測(cè)定技術(shù)有多種，包括激光粒度儀、動(dòng)態(tài)光散射、電鏡、光學(xué)顯微鏡等，但由于乳膏劑的半固體制劑形態(tài)，對(duì)其進(jìn)行顆粒表征的特殊挑戰(zhàn)在于^[1]：

① 在樣品制備時(shí)，不能因?yàn)橄♂?、蒸發(fā)或其他操作導(dǎo)致API/液滴顆粒大小發(fā)生變化；

② 要具有足夠高的對(duì)比度，能夠?qū)PI/液滴進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)和分析，因此光學(xué)顯微鏡成為了乳膏劑顆粒粒度和形貌分析的簡(jiǎn)單直接的工具。

用光學(xué)顯微鏡對(duì)乳膏劑進(jìn)行觀察時(shí)，通常采用“三明治"制樣法，即取少量樣品于載玻片上，蓋上蓋玻片后輕輕按壓使樣品延展鋪開成為薄薄的一層，這樣盡可能保證API顆粒的微環(huán)境和制劑的微觀結(jié)果不被破壞，避免了采用其他粒徑測(cè)定技術(shù)時(shí)導(dǎo)致乳膏中API顆粒溶解、析出、重結(jié)晶或乳滴顆粒因剪切力而變形、破裂等問題。

傳統(tǒng)方法的困境

常用于乳膏劑分析的普通光學(xué)顯微鏡包括亮視野顯微鏡和偏光顯微鏡(PLM)，亮視野顯微鏡用于觀察乳膏劑中的液滴顆粒，PLM則用于混懸API晶體顆粒的分析，但這兩種手動(dòng)模式的顯微鏡觀察法都存在明顯弊端：

① 顆粒代表性不足的問題。普通顯微鏡觀察樣品，通常只能獲得少數(shù)視野中幾十到至多幾百個(gè)顆粒的信息，而視野之外還有海量顆粒樣本被遺漏，所以很難通過觀察有限個(gè)數(shù)的顆粒樣本得到有統(tǒng)計(jì)代表性和可重復(fù)的粒度分布信息。而根據(jù)ISO13322-1: 粒度分析— 靜態(tài)圖像分析法^[2]：“當(dāng)采用圖像分析法測(cè)定粒度時(shí)，必須要統(tǒng)計(jì)一定數(shù)目的顆粒才能得到有意義的粒度結(jié)果……例如對(duì)幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6的粉末顆粒，誤差5%以內(nèi)以及概率為95%時(shí)，得到粉末的質(zhì)量中位徑，需要大約61000個(gè)顆粒?！?即使乳膏劑的粒度分布相對(duì)較窄，未必需要觀察數(shù)以萬(wàn)計(jì)的顆粒，但是如何確保顆粒樣本數(shù)量足夠和粒度統(tǒng)計(jì)信息具有代表性，仍然是普通顯微鏡觀察法面臨的最大難題。

② 分析人員主觀性偏差。普通顯微鏡觀察依賴于操作者挑選觀察視野和辨識(shí)顆粒，存在較強(qiáng)的主觀偏向性 ，有可能不同的操作者因?yàn)榕袛鄻?biāo)準(zhǔn)不一致或長(zhǎng)時(shí)間觀察的疲勞導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)較大的偏差，所以最好是由經(jīng)驗(yàn)豐富的、專門的分析人員進(jìn)行觀察和分析。

由于存在代表性不足、主觀誤差大且效率低下等先天不足，使采用普通顯微鏡測(cè)定乳膏劑顆粒粒徑成為了一門“玄學(xué)“，顯然無(wú)法滿足FDA外用半固體制劑仿制藥指導(dǎo)原則中所要求的對(duì)乳膏劑的微觀結(jié)構(gòu)特性（Q3）進(jìn)行準(zhǔn)確表征以與參比制劑進(jìn)行相似性評(píng)價(jià)的要求^[3]。

變“玄學(xué)"為科學(xué)

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和高精度微定位控制技術(shù)的發(fā)展，全自動(dòng)顯微鏡成為了顆粒圖像表征領(lǐng)域的Game Changer。與普通手動(dòng)顯微鏡相比，全自動(dòng)顯微鏡具有相同的高分辨率和成像質(zhì)量，并且能夠?qū)θ曇斑M(jìn)行自動(dòng)掃描、計(jì)數(shù)和成像，不僅解決了傳統(tǒng)顯微鏡法統(tǒng)計(jì)代表性不足問題，還將分析效率提升了數(shù)百倍，更好的滿足了藥物研發(fā)對(duì)于數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度、重復(fù)性以及時(shí)間效率的高要求。

Morphologi 4是馬爾文帕納科公司的最新一代全自動(dòng)顆粒圖像分析系統(tǒng)，符合靜態(tài)圖像分析國(guó)際技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)ISO13322-1, 可對(duì)0.5μm到幾個(gè)毫米范圍內(nèi)的顆粒進(jìn)行自動(dòng)掃描和快速成像，自動(dòng)統(tǒng)計(jì)顆粒數(shù)目和獲得顆粒高清圖像，分析顆粒大小和形貌特征，一次掃描的顆粒數(shù)目可從數(shù)千個(gè)到幾十萬(wàn)個(gè)以確保充分的代表性，并給出具有統(tǒng)計(jì)意義的顆粒粒度分布和形貌分布信息。

Morphologi 4 適用于不同類型的藥物樣品，除乳膏劑、混懸劑等劑型可以通過“三明治法"制樣進(jìn)行分析以外，還帶有自動(dòng)干粉分散裝置，可對(duì)原料藥、輔料和膠囊等干粉樣品進(jìn)行全自動(dòng)分散和掃描，是對(duì)原輔料和制劑進(jìn)行基于圖像法的量化分析和質(zhì)量控制的利器。

應(yīng)用案例

該案例中的樣品為主藥呈混懸狀態(tài)的半固體制劑，按照藥審中心《皮膚外用化學(xué)仿制藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求^[4]，混懸的藥物粒徑對(duì)其在皮膚局部的溶解度和釋放速率有關(guān)鍵影響，而液滴粒徑可反映處方工藝的合理性，并會(huì)影響藥物的釋放性能和透皮性能，因此要求對(duì)仿制藥的粒徑指標(biāo)進(jìn)行研究和控制，作為評(píng)價(jià)生物等效性的依據(jù)。

采用“三明治"制樣法，通過Morphologi 4自動(dòng)掃描分析，二十分鐘之內(nèi)即可獲得API顆粒和液滴顆粒的粒徑分布結(jié)果，以及API的晶癖和液滴顆粒的圓度值等形貌因子的分布值。

參考文獻(xiàn)：

[1]. D. W. Osborne, K. Dahl, H. Parikh. Determination of Particle Size and Microstructure in Topical. AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series 36

[2]. ISO13322-1: Particle size analysis — Image analysis methods Part 1: Static image analysis methods.

[3]. 邵鵬, 鄭金琪, 潘芳芳等. 外用半固體制劑的體外釋放試驗(yàn)和等效性評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2021, 38(20): 2481-2487。

[4]. 新注冊(cè)分類的皮膚外用仿制藥的技術(shù)評(píng)價(jià)要求，藥品審評(píng)中心。